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    預印本4天快審刊登Science:冷凍電鏡助力新冠疫苗開發!

    儀器信息網 2020/02/21 16:38:32 點擊 701 次
    [導讀] 2月19日,已于4日前發表在預印本網站bioRxiv的成果,被快速通過同行審議發表于《Science》期刊。該成果將對開發新冠疫苗提供幫助。

    儀器信息網訊 2月19日(美國時間),美國衛生總署(NIH)與美國得克薩斯大學奧斯汀分校Jason S. McLellan研究組首次利用冷凍電鏡解析新冠病毒刺突蛋白分子結構的成果在《Science》上發表,該研究已于2月15日發表在預印本網站bioRxiv,并快速通過同行審議發表于《Science》期刊。該成果將對開發新冠疫苗提供幫助。

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    ▊ 研究背景

    此前多項研究從不同角度證實,新冠狀病毒(2019-nCoV)感染人體細胞的方式與SARS-CoV類似:利用刺突蛋白(S蛋白)ACE2受體作用來感染人體細胞,即新冠病毒的S蛋白結合人體ACE2受體。

    于是,S蛋白和ACE2受體成為研究的兩大關鍵目標,本次《Science》成果正是利用冷凍電鏡技術解析了S 蛋白三維結構;而同一天(19日)西湖大學周強團隊預印版平臺bioRxiv發表成果則是利用冷凍電鏡技術解析了人ACE2受體三維結構。

    什么是S蛋白?

    刺突蛋白(S蛋白)是疫苗開發、治療性抗體和診斷方法的關鍵目標。根據S 蛋白的蛋白結構功能可以將其分成兩個功能單位:S1和S2蛋白亞基。S1能夠促進病毒結合到宿主細胞受體的能力,其含有一個重要的C端受體結合結構域(RBD),正是這個位置負責和受體結合。

    什么是ACE2受體?

    血管緊張素轉換酶2(ACE2)是SARS冠狀病毒(SARS-CoV)的表面受體,與S蛋白直接相互作用。 ACE2也被認為是新冠狀病毒(2019-nCoV)的受體,表現為嚴重的呼吸綜合征。ACE2主要生理作用是促進血管緊張素的成熟,在肺、心臟、腎臟和腸道廣泛存在。但當病毒入侵時,ACE2就被病毒“綁架”了。

    西湖大學研究團隊稱:“在SARS病毒和‘新冠病毒’侵入人體的過程中,ACE2就像是‘門把手’,病毒抓住它,從而打開了進入細胞的大門!

    ▊ 研究要點

    1)新冠狀病毒的S蛋白結構是疫苗應對的關鍵區域

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    預融合構象中的2019-nCoV S的結構:(A)2019-nCoV S一級結構示意圖,按域著色;(B)具有向上構象的單個RBD的2019-nCoV S蛋白的預融合結構的側視圖和俯視圖。

    2019-nCoV利用密集的S蛋白進入宿主細胞。S蛋白是一種三聚體I類融合蛋白,存在于亞穩態的預融合構象中,該構象經過劇烈的結構重排以使病毒膜與宿主細胞膜融合。當S1亞基與宿主細胞受體結合時,觸發該過程。受體結合會破壞融合前三聚體的穩定性,導致S1亞基脫落,并使S2亞基轉變為穩定的融合后構象。為了與宿主細胞受體接合,S1的受體結合域(RBD)經歷了鉸鏈狀構象運動,該構象運動暫時隱藏或暴露了受體結合的決定因素。這兩個狀態分別稱為“向下”構象和“向上”構象,其中向下對應于受體不可及的狀態,向上對應于受體可及的狀態,受體結合狀態不太穩定,是抗體介入的較好目標。因此,預融合S蛋白結構的表征將提供原子水平的信息,并指導疫苗的設計和開發。

     2)2019-nCoV具有與冠狀病毒科相同的觸發機制

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    2019-nCoV S蛋白的表達與純化

    研究組制備獲得了約0.5 mg / L的重組前融合穩定Sectodomain,并通過親和層析和尺寸排阻層析將蛋白質純化至均質(上圖)。使用這種純化的、完全糖基化的S蛋白進行冷凍電鏡表征。

    收集并處理了3207張顯微照片后,獲得了一個3.5 埃分辨率的非對稱三聚體的三維重構圖像,其中一個RBD在此構象中被觀察到。通過在cryoSPARC v2中使用3D可變性功能,我們觀察到RBD經歷了鉸鏈狀運動時S1亞基的呼吸(見以下視頻),這可能是導致S1的局部分辨率較差(與穩定的S2亞基相比)。這種看似隨機的RBD運動已在密切相關的β冠狀病毒SARS-CoV和MERS-CoV以及更遠相關的α冠狀病毒豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的結構表征中捕獲。在2019-nCoV S中對該現象的觀察表明,它具有與冠狀病毒科相同的觸發機制,其中受體與暴露的RBD結合導致不穩定的3 RBD-up構象,并導致脫落S1和S2的重新折疊。

    從側面沿著病毒膜看2019-nCoV S三聚體

    從頂部朝病毒膜方向看2019-nCoV S三聚體

    因為S2亞基是一個對稱的三聚體,研究者對其進行了3D優化,增加了C3的對稱性,得到了一個3.2 埃分辨率的圖,S2亞基的密度非常好。利用這兩種圖譜,構建了大部分2019-nCoV S胞外域,包括每個三聚體的66個N聯糖基化位點中的44個的聚糖(見下圖)。

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    冷凍電鏡圖和N-聯糖基化位點:(A)經C3處理的2019-nCoV S的未銳化低溫EM密度圖的不對稱單位顯示為透明分子表面

    3)2019-nCoV的S蛋白與ACE2受體親和力高于SARS-CoV:更易人傳人?

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    2019-nCoV S以高親和力結合人ACE2

    最近的報道表明2019-nCoV S和SARS-CoV S具有相同的功能宿主細胞受體-血管緊張素轉換酶2 (ACE2),這促使研究者通過表面等離子體共振(SPR)來量化這種相互作用的動力學。ACE2與2019-nCoV S外域結合,其親和力約為15 nM,比ACE2與SARS-CoV S結合的親和力高出10- 20倍(上圖A)。研究者還制備了與2019-nCoV S胞外域結合的ACE2的復合物,并通過負染色電鏡技術對其進行了觀察,冷凍電鏡高分辨觀察發現(上圖B),它與SARS-CoV S和ACE2之間形成的復合物非常相似。表明2019-nCoV S對人ACE2的高親和力可能有助于使2019-nCoV S在人與人之間傳播變得明顯容易,但還需要更多研究來研究這種可能性。

    4)針對SARS-CoV的多克隆抗體不能與2019-nCoV結合

    基于SARS-CoV和2019-nCoV之間的整體結構同源性和共同的受體,研究者測試了已發表的3種針對SARS-CoV RBD區域的多克隆抗體(S230、m396和80R),對其交叉反應性進行評估。結果顯示此3種抗體在新冠病毒中完全沒有結合力。表明針對SARS-CoV的多克隆抗體對于2019-nCoV不一定奏效。

    ▋小結

    了解2019-nCoVS蛋白原子水平結構將有助于進一步的蛋白質工程研究,以改善抗原性和蛋白質表達,從而助力疫苗開發。這些結構數據也有助于評估2019-nCoV突變,該突變將隨著病毒的遺傳漂移而發生;并有助于確定這些殘基是否有表面暴露,并映射到其他冠狀病毒突變蛋白的已知抗體表位。此外,原子水平的細節將使設計和篩選具有熔合抑制潛力的小分子成為可能。這些信息將為精確疫苗設計和抗病毒治療的發現提供支持,從而加速醫學對策的發展。

    McLellan在接受新華社記者采訪時表示,他們已將這一結構的原子坐標數據發送給全球多家實驗室,其中多數來自中國,目前已有大約25家中國實驗室要求獲取相關資料。

    并表示,這一成果可幫助研究人員展開三個方面的工作。第一,展開潛在藥物篩查,發現可與這種刺突蛋白結合并破壞其功能的小分子;第二,設計可以與刺突蛋白結合并抑制其功能的新型蛋白分子或抗體;第三,設計出這種刺突蛋白的變體,例如使其擁有更高表達水平或熱穩定性,從而誘發更強的免疫反應,以加快疫苗開發。

    附:研究中應用到的部分主要儀器設備

    冷凍電鏡:配置K3相機(Gatan)的Titan KriosThermo Fisher

    透射電鏡:配置Ceta 16M相機的FEI Talos TEMThermo Fisher

    冷凍制樣設備:Vitrobot Mark IV(Thermo Fisher

    生物大分子相互作用分析儀Biacore X100GE Healthcare

    色譜柱:Superose 6 10/300(GE Healthcare

    等離子清洗儀Solarus 950Gatan



     


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